兔骨髓间充质干细胞构建心脏电传导通路的潜能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6597-6602.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.007

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兔骨髓间充质干细胞构建心脏电传导通路的潜能

周浩粤¹，卢炯斌²，邱汉婴³

¹揭阳市人民医院心内科，广东省揭阳市 522000；²东莞市人民医院心内科，广东省东莞市 523000；³汕头大学医学院第一附属医院心内科，广东省汕头市 515000

修回日期:2014-09-15 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 周浩粤，硕士，主治医师，揭阳市人民医院心内科，广东省揭阳市 522000
作者简介:周浩粤，男，1980年生，广东省揭阳市人，汉族，2010年汕头大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事心内科及心脏电生理方面研究。

Construction of cardiac atrioventricular electrical conduction pathway by rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Zhou Hao-yue¹, Lu Jiong-bin², Qiu Han-ying³

¹Department of Cardiology, People’s Hospital of Jieyang City, Jieyang 522000, Guangdong Province, China; ²Department of Cardiology, People’s Hospital of Dongguan, Dongguan 523000, Guangdong Province, China; ³Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Shantou Medical University, Shantou 515000, Guangdong Province, China

Revised:2014-09-15 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Zhou Hao-yue, Department of Cardiology, People’s Hospital of Jieyang City, Jieyang 522000, Guangdong Province, China
About author:Zhou Hao-yue, Master, Attending physician, Department of Cardiology, People’s Hospital of Jieyang City, Jieyang 522000, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体干细胞移植到心脏是目前治疗心力衰竭的一个研究方向，但自体骨髓间充质干细胞移植针对心脏传导系统方面的研究相对较少。

目的：评价兔骨髓间充质干细胞是否具有治疗心脏传导阻滞方面疾病的潜能。

方法：获取兔骨髓间充质干细胞并利用5-氮胞苷诱导为心肌样细胞。14只新西兰大白兔开胸手术后，将左心耳左心室前壁进行缝合(实验组8只，对照组6只)。术后1个月将实验组兔经5-氮胞苷诱导4周的自体骨髓间充质干细胞采用DAPI标记后，开胸直视下注射入左心室前壁-左心耳左心室缝合瘢痕区-左心耳；对照组予以培养基替代细胞。细胞移植后1个月再次开胸暴露心脏，在左心耳、左室前壁分别插入电极，进行心脏房室旁道的电生理检测，观察骨髓间充质干细胞是否在左心房左心室缝合瘢痕区形成房室旁道。

结果与结论：细胞移植到兔左心耳左心室缝合区后，实验组有2只兔子在行电生理刺激时心电图提示有房室旁道形成。移植后心脏冰冻切片在荧光显镜下能观察到移植的细胞在左心室和缝合区存活，而对照组则未有上述表现。骨髓间充质干细胞表达Cx43并与心肌细胞形成间隙连接的特点结合在细胞移植组中形成房室旁道的心脏电生理检测表现，提示骨髓间充质干细胞具备能够用于治疗心脏传导系统阻滞相关疾病的可能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 心脏电生理, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 房室旁路

Abstract:

BACKGROUND: Autologous stem cell transplantation to the heart is a research direction of heart failure treatment, but there are relatively few of studies about autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation targeting the cardiac conduction system.

OBJECTIVE: To evaluate the potential of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of heart block.

METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were induced by 5-azacytidine to differentiate into cardiomyocyte-like cells. After thoracotomy, the left atrium-left ventricular anterior wall was sutured in 14 New Zealand white rabbits (8 in the experimental group and 6 in the control group). One month after the surgery, in the experimental group, autologous bone marrow mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine for 4 weeks were labeled with 4',6-diamidino-2-phenylindole and then injected into the suture area when opening the thoracic again. In the control group, cells cultured in medium were used. One month after cell transplantation, the third thoracotomy was done to insert electrodes into the left atrium and left ventricular anterior wall, for cardiac electrophysiological detection. Whether atrioventricular pathway formed in the suture area was observed.

RESULTS AND CONCLUSION: After cells were transplanted into the sutured area, two rabbits in the experimental group were discovered to form the atrioventricular pathway in the sutured area through cardiac electrophysiological examination. After transplantation, transplanted cells were visible on the heart frozen sections under fluorescence microscope in the left ventricle and sutured area, but there was no cell in the control group. In the experimental group, bone marrow mesenchymal stem cells expressed Cx43 and formed gap junction intercellular communication with cardiomyocytes, which was presented as formation of the atrioventricular pathway on cardiac electrophysiology examination. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells can be used to treat cardiac conduction system block diseases.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, cardiac electrophysiology

中图分类号:

R394.2

周浩粤，卢炯斌，邱汉婴. 兔骨髓间充质干细胞构建心脏电传导通路的潜能[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6597-6602.

Zhou Hao-yue, Lu Jiong-bin, Qiu Han-ying. Construction of cardiac atrioventricular electrical conduction pathway by rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6597-6602.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 参加实验兔数量总共为14只，其中实验组8只，对照组6只，其中实验组1只兔子在移植细胞后，心脏电生理检测术前麻醉时死亡，对照组1只兔子在行开胸手术，左房左室缝合时意外死亡。其余兔子存活至整个实验结束，最终实验组有7只，对照组有5只兔子进入最后统计分析。

2.2 房室缝合区组织苏木精-伊红染色和苦味酸-天狼星红染色 实验组心肌标本苏木精-伊红染色结果提示，普通光镜下不能分辨正常心肌细胞与骨髓间充质干细胞分化形成的心肌样细胞，在左心房左心室缝合形成的瘢痕连接处，观察到有少量肌组织样结构形成。苦味酸-天狼星红染色后，正常心肌织呈淡黄色表现，而纤维结缔组织呈胭脂红样染色^[23]。房室缝合处，形成纤维结缔组织，粘连较为紧密，可以成为细胞移植的平台，见图3A。在实验组中，可见散在、团状或断续条索淡黄色组织夹杂于纤维组织中，对照组无上述表现，但是值得注意的是，单纯的天狼星红染色不能确定有无心肌组织在瘢痕组织中形成，见图3B。

2.3 观察经5-氮胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞在移植后的存活情况 经荧光显微镜观察实验组细胞移植后存活情况，发现移植于正常心房与心室肌处的细胞存活较多，细胞分化好，苏木精-伊红染色下与正常心肌细胞难以区别，见图4A；而移植左房左室缝合部位的细胞能够在房室缝合处的瘢痕组织存活，但散在分布，呈细胞团或细胞索，细胞存活数量相对较稀少，明显少于接种于正常心肌处，见图4B。

2.4 移植前后体表常规心电图检测结果 实验组细胞移植前后常规心电图各项指标观察差异无显著性意义(表1)，术前所有兔电生理检测未发现旁道(P > 0.05)。两组心率、PR间期、ORS间期在体表心电图上差异亦无显著性意义 (P > 0.05)，常规体表肢导联也未发现detla波(表2)。

2.5 房室旁道心脏电生理检测 结果见图5。经分级递增起搏法和连续递增超搏法检测发现，在实验组中，有2只兔子采用分级递增起搏法刺激心房时，在起搏阀值为 0.6 mV，S₁-S₁间期为190 ms时，S₁-R间期为98 ms，ORS间期为52 ms，S₁-R间期随着S₁-S₁间期缩短而逐渐延长，见图5B。但是当S₁-S₁间期缩短至135-140 ms时，S₁-R间期出现明显缩短伴随QRS波变化，S₁-R间期从98 ms缩短为41 ms，而QRS波出现Q波明显缩小，时程延长至60 ms (这些兔在未实行刺激时，PR间期约为87 ms，QRS约为53 ms)，见图5C。但未能观察到类似人类心电图的典型detla波出现；在S₁-S₂刺激模式下，上述实验组中S₁-R间期缩短的兔出现S₂期前刺激后短阵的阵发性室上性心动过速表现，且R-P’间期短于PR间期，见图5D；而对照组兔皆未出现上述实验结果，未发现有S₁-R间期缩短及QRS波群变化，亦未观察到detla波出现。所有兔以同样的程序刺激左心室，未能观察到隐匿性旁道的存在。

上述实验组中出现电生理刺激改变的兔子同样未能检测到旁道逆传现象。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009年4月至2011年5月在汕头大学医学院肿瘤与分子生物实验室及动物心脏电生理实验室完成。

材料：

实验动物：两三个月龄新西兰大白兔14只，体质量2.0-2.3 kg，由汕头大学医学院实验动物中心提供，雌雄不拘。实验过程及规范经过汕头大学医学院医学伦理委员会批准。

实验方法：

构建兔心脏房室电传导新通道细胞移植的解剖平台：两三个月龄新西兰大白兔14只，随机分为实验组8只与对照组6只。3%戊巴比妥经静脉注射麻醉后，取仰卧位，四肢固定后刺入体表电极连接POWER Lab心脏多导生理记录仪，使用Chart5 for Windows软件记录体表Ⅱ导联心电图，测定术前心率、PR间期、QRS宽度。消毒后沿兔左胸骨边缘0.5-1.0 cm剪开胸前肌组织，暴露左胸第3-5肋骨，剪开左胸第3-5肋骨，以乳突撑开器暴露纵膈心包，剪开心包行心包吊床术，暴露左房、左室，于左心耳左心室前壁刺入自制4脚电极，行心脏电生理刺激检查，排除自身旁道存在。再以手术刀片仔细刮擦左室前壁左前降支与左旋支之间区域及左心耳，制造新鲜创面，使用3-0#缝线下拉左心耳至左室前壁创面进行缝合，面积约为 5 mm×2 mm。术后逐层关闭胸腔，若有气胸则予抽气，手术完成后每日腹腔注射青霉素40×10⁴ U，连续7 d预防感染。

骨髓间充质干细胞移植：术后1个月，依前期研究方法获取骨髓间充质干细胞并诱导分化为心肌样细胞^[8^，^20-27]。取5-氮胞苷诱导4周的自体骨髓间充质干细胞^[20^，^22]，术前 1 d避光下予DAPI孵育12 h，手术当天用PBS冲洗3遍，胰酶消化后离心洗涤2次，予含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬计数，计数后浓缩于0.5 mL左右培养基中，置冰上备用。取实验组兔，再次麻醉后，于同一手术部位开胸，暴露心脏，将细胞用1 mL注射器经左室前壁-左心房左心室缝合瘢痕区-左心房途径分次注射到左室前壁、左房室壁缝合瘢痕区、左心耳处，细胞移植总数为(2.0-2.5)×10⁶个，见图1。对照组予培养基代替细胞。术后同样予腹腔注射青霉素预防感染。

心脏电生理检查是否存在由骨髓间充质干细胞构建的房室心电传导新通道：细胞移植后第4周，取两组实验动物进行心脏电生理检查，全麻下做气管切开，接呼吸机，四肢接POWER Lab心脏多导生理记录仪，使用Chart5 for Windows软件记录用于体表肢体导联心电图以及左心房左心室心外膜心电图。再次开胸后，充分暴露左心耳左心室，在左心耳和左心室前壁分别插入1个自制4脚电极，每个电极前后两极相距0.2 mm，左右相距0.4 mm，见图2。分别连接PowerLab多导生理记录仪与SEC-2102型心脏刺激器，以略高于起搏阀值进行电刺激，重点进行有关旁道存在于否的心脏电生理检测。分别采用下列方法进行检测^[8，21]：①分级递增起搏法：以略高于实验兔自身心率的频率心房起搏，每级递增10次/min，持续10-20 s，依次递增。②连续递增起搏法：以接近实验兔自身心率的频率心房起搏，连续增加起搏频率；上述两种方法观察随频率的增加S₁-R间期、QRS波时程变化，有无出现Δ波(delta波)。③S₁同步S₂程控扫描法(S₁-S₂法)：以略高于实验兔自身心率的频率心房起搏，每8次S₁脉冲后，发放S₂刺激，S₁-S₂间期每次递增或递减5 ms，观察S₂后的QRS波群有无逐渐增宽，有无出现Δ波或不典型的Δ波典型化，S₂-R间期有无延长(预激时不延长)，是否存在房室折返性室上性心动过速，以及R-P间期变化；以同样方法左室起搏，观察房室间是否存在隐匿性旁道。记录刺激前后PP间期，PR间期，QRS间期，S₁-R、S₁S₁间期、S₁S₂、S₂-R间期等^[8,21]。实验完成，全麻下处死动物，获取心脏，剪取左心房左心室，分成两部分，一部分制作冰冻切片后，在荧光显微镜下观察移植细胞存活状况，在紫外光下，经DAPI标记染核的骨髓间充质干细胞发蓝光；部分制成蜡块，切片用于苏木精-伊红染色和苦味酸-天狼星红染色^[9,22]，分别观察房室缝合处骨髓间充质干细胞存活状况及类心肌的组织形成和瘢痕组织大体状况，对照组兔行同样处理。

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讨论

在前期实验中，验证了骨髓间充质干细胞经过诱导后表达Cx43增强的同时，细胞间间隙连接的功能也有增强^[16]。间充质干细胞-间充质干细胞与间充质干细胞-心肌细胞间间隙连接的形成是构建房室电传导旁道的细胞基础。

3.1 移植骨髓间充质干细胞在心肌中的存活情况曾有文献提出，骨髓间充质干细胞移植在瘢痕组织中受其影响会发育成为纤维细胞或其他细胞^[11]，因此本实验移植经过5-氮胞苷诱导后4周的己定向分化为心肌样细胞的骨髓间充质干细胞，避免移植的骨髓间充质干细胞在房室瘢痕区分化为纤维细胞或其他类型细胞。在实验组心肌标本的观察中，发现房室瘢痕区中移植骨髓间充质干细胞存活较为稀少，多呈散在不连续分布，部分呈细胞团分布，存活率低于移植于心室肌部位的细胞与天狼星红染色结果相一致。与既往文献的报道较为一致，这种情况可能为瘢痕区毛细胞管稀少，血液供应不足，导致细胞处于缺血缺氧状态，影响细胞存活率^[10^，^12]。而心室肌中，由于血液供应情况良好，细胞存活情况明显提高。有文献研究指出，在骨髓间充质干细胞移植前通过预缺氧适应等实验方法，可以提高骨髓间充质干细胞移植后在瘢痕区等缺血缺氧区域的存活率，从而提高移植效果及细胞移植成功率^[24-26]。因此提高骨髓间充质干细胞在瘢痕区的存活率将是下一步研究的重点之一。取对照组兔左心房左心室缝合区标本分别进行天狼星红染色和苏木精-伊红染色，观察到房室间形成无法传递电冲动纤维组织，在本实验中，未观察到心房肌与心室肌细胞直接融合接触的情况，说明单纯的手术缝合心房心室，无法在心房与心室间构建新的房室心电传导通道，心脏电生理刺激结果同样支持这一结论。

3.2 体表常规心电图的分析在实验组、对照组手术处理前后，体表心电图肢导联并未观察到有明显的PR间期缩短，也未观察到有显性的detla波出现，实验组中出现该结果可能与下列情况有关：一种情况可能是移植存活的细胞少，形成的房室旁道不稳定，甚至少到不足以形成连续性的电传递通道，这种情况从实验组大部分个体电生理检测表现为阴性结果相符合。而另一种情况则可能是骨髓间充质干细胞分化后细胞特性所决定，可能是细胞的兴奋性、传导性比较于心肌传导组织细胞要低，导致电冲动不容易通过^[22]。但这种情况的证实有待于在下一步的实验中继续研究，目前也不排除第一种情况影响第二种情况存在的可能性。

3.3 骨髓间充质干细胞在实验组中形成房室旁道的探讨在实验组心脏旁道的电生理检测中，采用0.5-0.6 mV电压强度进行刺激，实验组7只兔中有2只在行分级递增起搏刺激时，当S₁-S₁>150 ms时，S₁-R随S₁S₁周期缩短而延长，但当S₁-S₁缩短至135-140 ms，S₁-R随即缩短到41 ms左右，并能够在持续刺激下稳定下传，且伴有QRS波的改变，起始部Q波振幅明显缩小，QRS波增宽，时程延长到60 ms，符合心脏房室旁道的电生理表现。在同步左心室前壁电极监测心电图中，可以明确观察到刺激电位诱发心房电位之后出现心室电位。当S₁-S₂缩短至135-140 ms时，可以诱发出房室折返性心动过速，且有R-P’<P-R，提示了旁道存在的可能，表现为间歇前传。但无论是连续S₁-S₁刺激所致的PR间期缩短还是S₁-S₂诱发的房室折返性心动过速，一旦刺激停止，都不能长时间保持，作者考虑是由于房室缝合区内，骨髓间充质干细胞存活相对少，细胞间连接不稳定，因此所形成的电传递通道存在不稳定，从而导致需要较大的电压刺激才能下传，同时由于上述因素的影响，电冲动不能稳定下传。而在实验组中，其余的兔子未观察到类似现象，作者认为可能是移植的细胞存活过少以致无法形成房室旁道。在实验中发现一个有意思的现象，即当采用心室刺激的方式检测房室旁道时，并不能很好诱发出房室折返性心动过速，与Choi等^[5]报道结果类似，可能与细胞仅存在前传功能有关，具体原因尚不明确。而对照组中，所有兔皆未观察到上述电生理现象发生。

该实验创新性的将兔左心耳与左心室游离壁进行缝合构造细胞移植平台后，移植诱导后朝心肌细胞分化的骨髓间充质干细胞，构建心脏电活动传导通路，并同时验证该方法实施可能性。在下一步的研究中，希望建立稳定的旁道模型，以便更进一步了解由骨髓间充质干细胞所构建的旁道的电生理特点，为以后临床上用于治疗缓慢心律失常特别用于治疗心脏传导系统阻滞疾病的的相关研究打下基础。本实验的不足之处在于实验例数为小样本，移植平台的构建及细胞移植存活率等多因素影响可能实验结果，需要进行更多例数的实验以便更好的确定骨髓间充质干细胞所形成的房室电传递通道的性质及特点，以及是否能够被抗心律失常的药物所影响；同时改进实验方法以提高实验组的阳性率。诱导后骨髓间充质干细胞的细胞电生理特点需要更进一步的研究，明确与正常心肌传导细胞的电生理特点的差异。

结论：骨髓间充质干细胞能够做为心脏细胞移植的理想细胞，优势有：①易于取得，不存在法律及伦理问题。②在分化为心肌细胞同时，能与心肌细胞在移植早期即形成间隙连接，保证了心肌细胞电活动的稳定。③分化成为心肌细胞后CX43表达与功能增强，从而改善心肌传导功能^[10]；并且骨髓间充质干细胞还能发挥细胞旁分泌效应来改善心功能^[28-30]。上述特点将有利于推动骨髓间充质干细胞用于心肌移植的进一步研究。

目前将骨髓间充质干细胞与基因工程相结合，己经使骨髓间充质干细胞在生物起搏器研究方面取得令人鼓舞的进展^[14-15]。尽管还存在许多细节方面问题尚待解决，但骨髓间充质干细胞的独特生物学特点使它可能成为一种种子细胞用于修复或再造传导系统，骨髓间充质干细胞也将在生物治疗心脏传导阻滞方面显示出其独特优势^[17-19]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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